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Nature报道Cas9技术突破：利用CRISPR/Cas9有效引入特异的纯合子

来自洛克菲勒大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9成功地有效引入了特异的纯合子和杂合子突变。这一突破性的成果发布在4月27日的《自然》（Nature）杂志上。

　　细菌CRISPR/Cas9系统使得人们能够在许多生物中实现序列特异性的基因编辑，有望成为在人类多能干细胞中建立人类疾病模型的一种强大工具。CRISPR/Cas9能够以高效率引入靶向DNA双链断裂(DSBs)，然而通常由非同源末端连接（NHEJ)介导的修复过程会导致非特异性的插入、缺失或其他突变(indels)。

　　DSBs也可以通过同源指导修复(HDR)利用DNA修复模板，如导入的单链寡核苷酸(ssODN)来进行修复，由此敲入特异的突变。尽管当前CRISPR/Cas9被广泛用于借助NHEJ来操控基因敲除，通过HDR实现基因编辑仍然低效，并可遭到其他indels的破坏，阻碍了它通过引入基因相关突变广泛用于建立遗传疾病模型。此外，迄今为止尚未有人报道成功地在单等位基因处实现靶向突变敲入来构建出杂合子突变引起的疾病。

　　在这篇Nature文章中，洛克菲勒大学的Marc Tessier-Lavigne和同事们描述了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架，它使得能够以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变。研究人员证实，通过整合一些阻断CRISPR/Cas沉默突变及致病突变可以显著提高HDR的精度，并建立了一种叫做“CORRECT”的方法来实现无痕基因组编辑。

　　通过确定一个突变的掺入率以及它与DSB距离之间固定不变的逆相关关系的特征并利用它，研究人员实现了可预测地控制纯合性。引入纯合子突变要求向导RNA靶向目的突变附近，而引入杂合子突变则可通过距离依赖性的次优突变掺入，或利用混合修复模板来实现。

　　利用这种方法，他们构建出了具有杂合子和纯合子显性早发阿尔茨海默病致病APPSwe和presenilin 1 (PSEN1M146V)突变的人类诱导多能干细胞及衍生的大脑皮层神经元，这些细胞显示出基因型依赖性的疾病相关表型。

　　新研究实现了利用CRISPR/Cas9有效地引入特异性的序列改变，这一突破性的成果将推动人类的疾病研究。