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realtime-PCR技术服务

    实时荧光定量PCR（RealtimePCR，QPCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用。

扩增曲线

RT-PCR检测引物特异性

电泳图

    Realtime PCR 是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。

    但是，realtimePCR的高度灵敏的特点，也导致结果极易受多种因素的影响，如RNA提取质量、逆转录效率、扩增效率、扩增特异性等。因此realtimePCR时常出现不同批次样品重复性差，样品间差异明显，扩增曲线差别大以及非特异扩增影响实验数据分析等多种问题。常常需要花费大量的时间和精力反复对实验结果进行优化才能获得可供分析的实验数据。
 

   我们在realtimePCR实验的样品制备，引物和探针设计，以及实验条件优化有丰富的经验；采用高质量Hotstart Taq DNA聚合酶作为配制反应mix（详见realtimePCR产品），并且根据Taqman探针法和SBGR1染料法分别进行优化，最终为您提供可信度高的，可供发表的实验结果。


    一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（threshold value）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。

 

委托服务流程
1、 签订服务合同：由公司专业的客户服务人员与您就具体的实验情况进行沟通，确定实验方案并签订委托服务协议。
2、设计引物：根据客户提供的目的基因及物种信息，设计、合成特异的引物和探针。并根据客户的具体研究情况选择适宜的内参基因。
3、样品处理：

A、客户提供组织、细胞，公司提取RNA并进行RNA的电泳检测
B、客户提供RNA，公司直接进行电泳检测
C、客户提供cDNA，公司进行内参基因的PCR检测
4、Realtime－PCR实验：
A、RNA进行逆转成cDNA
B、利用合成的引物进行普通PCR预实验，选择只有扩增出一条特异条带的引物进行定量PCR
C、构建标准品，建立标准曲线
D、利用ABI公司提供的进口原装试剂盒在ABI7900HT仪器上进行Realtime－PCR 实验
5、出具实验报告：包括样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品的PCR扩增曲线，溶解曲线和标准曲线。

服务特点

可接受细胞组织、RNA及cDNA样品协助设计实验方案免费提供实验内参结果可靠，重复性高提供完整的实验报告