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慢病毒载体生产细胞的研究进展与展望

经过20年的临床试验，基因疗法在治疗一系列疾病方面显示出有效性。目前，有几种基因治疗产品获得批准并用于临床。慢病毒载体（LVs）是最常用的传递遗传物质的载体之一，也是修饰造血细胞以纠正原发性免疫缺陷、血红蛋白病和白细胞营养不良的首选载体。LVs还广泛用于修饰T细胞以在免疫疗法中治疗癌症（例如嵌合抗原受体T细胞疗法，CAR-T）。在基因组编辑中，LVs用于递送序列特异性设计核酸酶和DNA模板。批准LV基因治疗产品（如Kymriah，用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病；用于β-地中海贫血治疗的慢珠蛋白）强化了改善其生物加工制造的需求。生产主要依赖于瞬时转染。从稳定的细胞系生产有利于符合GMP的工艺，提供更容易的放大、再现性和成本效益。然而，建立稳定的LV生产细胞系存在几个困难，其中一些载体蛋白的细胞毒性是一个主要挑战。基因组编辑技术给LV生产细胞带来了额外的挑战。本文对LV稳定细胞系发展中的主要瓶颈、最新成就和前景进行了修订。

科学知识的积累和技术的进步加速了人类疾病背后的细胞和分子机制的发现。尽管如此，遗传病引起的疾病仍然对现代医学提出了巨大挑战。为了解决未满足的医疗需求，基因疗法作为一种有希望的方法出现，使医学革命能够提供长期效果的治疗。【1，2】因此，基因治疗成为一个极具吸引力且快速增长的领域，其市场规模在2018年达到50万美元，预计到2026年将增长40%。在接下来的几年里，有希望的治疗产品有望进入全球市场，实现其预演的基因治疗潜力。慢病毒载体是目前临床试验中使用最多的载体之一。基因治疗中最常用的病毒来自人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），尽管已开发出几种非灵长类替代病毒，如猫免疫缺陷病毒（FIV）或马传染性贫血病毒（EIAV）。【3，LVs转导增殖和非增殖细胞的能力以及它们通过基因组整合提供的长期表达，使它们成为几种基因疗法中的选择载体。【5，LVs对造血细胞（如T细胞）的有效转导使其成为癌症免疫治疗中有吸引力的工具，这有助于增加对这些载体的兴趣。在过继性T细胞癌症治疗中，自体T淋巴细胞被基因修饰以表达T细胞受体（TCRs）或嵌合抗原受体（CAR），从而将其抗原谱扩展或重定向至恶性细胞。【7-10】在过去5年中，两款基于CAR-T LV的治疗产品已获得市场批准，其中几款正在临床试验中，这增加了LV的生产需求。【11】然而，LVs的工业生产一直具有挑战性，产量低且成本低。使用和开发新的左心室生产细胞系以满足商业临床需求已被证明是最有效的方法。

1、用于病毒生产的细胞培养系统

病毒载体的生产主要依赖于在2D静态系统中培养的贴壁细胞。这些可以包括培养皿和T型烧瓶，但为了维持更大的规模，使用了细胞工厂和滚瓶。【26】培养条件的有限可扩展性和操作控制是这些系统的主要缺点。扩大培养表面积意味着增加相同平行培养单元的数量（横向扩展），这在空间、操作、处理时间和污染风险方面构成了挑战。【12，27】或者，可以使用填充床生物反应器，例如iCELLis（Pall）、tide cell（Vaccixcell）或cel cradle（colifescients）。具有集成灌注的固定床生物反应器允许在封闭和受控的培养环境中扩大基于贴壁细胞的系统，从而实现更高的细胞密度。【12】大多数贴壁培养系统仍补充有动物来源的血清，如胎牛血清（FBS）。FBS是使用最广泛的动物源性产品之一，但其批次间的可变性增加、微生物污染的风险、高价格和费力的下游纯化使其使用非常成问题。【12】如今，各种无血清培养基可用于贴壁细胞，为FBS提供了良好的替代品，如Pro293A-CDM或UltraCulture无血清培养基（Lonza）。后者在其制剂中含有重组蛋白或/和牛血清蛋白的纯化混合物来替代FBS。

或者，贴壁细胞可以适应无血清悬浮培养，提供从实验室到工业规模生物反应器的可扩展性。搅拌罐式生物反应器系统可实现封闭、可扩展和经济高效的生产，同时更好地监控和控制操作，以确保最佳培养条件（pH、pO2、pCO2）。此外，集成到悬浮生物反应器中的灌注技术支持更高的细胞密度和存活率，这最终提高了载体生产率并允许多次上清液收获。

2、转染或者稳定的生产细胞系

人胚胎肾（HEK）293细胞及其衍生的293T细胞是最广泛用于LV生产的细胞系。293T细胞是优选的，主要是由于大T抗原的表达（促进oriT质粒的持久性），据报道，大T抗原赋予了优异的生长、转染效率和载体生产能力，使它们在载体生产中在生理学上更加稳健。

用于LV制造的第一个也是最常用的系统是基于瞬时生产，通过用多质粒系统快速有效地共转染293T细胞。【12】转染后48-72小时收获病毒上清液，产生的滴度在106-108转导单位（t . u .）mL-1内。【29】使用的转染试剂通常是与带负电荷的DNA复合的阳离子试剂，允许其通过胞吞作用被细胞摄取。【30】聚乙烯亚胺（PEI）和磷酸钙是贴壁或悬浮培养物有效细胞转染的首选试剂。【31，32】物理转染方法（如细胞电穿孔）是化学转染方法的有趣替代方法，因为它们不需要昂贵的转染试剂。【33，34】尽管前景看好，但后者在大规模实施之前仍需要进一步开发和简化。

尽管使用了大规模瞬时LV生产，但这不是扩大规模的理想系统，因为需要大量高纯度DNA和转染试剂。【19】此外，它们还存在批与批之间的差异和生产周期短的问题，从而导致生产成本上升。【19，35，36】瞬时转染系统限制了生物反应器的操作模式，使其受限于短的生产窗口和次优的培养条件。基于LV的疗法的增长导致了对载体制造的高需求。瞬时生产系统不能满足大规模、低成本、高滴度生产的需求，这使得稳定的生产细胞系成为一种有吸引力的生物生产替代方案。

稳定的生产细胞系（诱导型或组成型系统）代表了LV生产的优选选择，因为它提供了可重复和可扩展的生物过程，同时降低了成本。转染步骤的取消通过降低病毒表达构建体之间重组的可能性增加了生产的生物安全性，这种重组在瞬时生产中更容易发生。【36】还可以通过使细胞系适应无血清悬浮培养物来提供可扩展性。所有这些特点都有助于行业和监管机构充分接受稳定的LV生产系统，从而加快市场批准速度。

用于病毒载体生产的大多数方法都是从标准生物制药生产过程中改编而来的。因此，作为连续操作的处理概念可以用于矢量制造。生物制药（如单克隆抗体生产）高度采用连续工艺，连续收获产品，然后进行直接下游加工。稳定的生产细胞系使连续的LV生产成为可能，允许充分利用灌注中的大规模生物反应器来获得最大的载体产量。尽管需要一些进展来实现完整的连续过程，但预计这将是基因治疗制造的未来。

3、稳定包装细胞的发展

在LV生产中使用稳定的包装细胞系优于瞬时转染系统。因此，它们在基因治疗标准生物过程中的应用代表了一个强制性的里程碑。【19】然而，稳定包装细胞的开发一直具有挑战性，主要是由于载体生成所需的一些基因产物的毒性。【27】HIV-1蛋白酶（gag-pro-pol病毒盒）和VSV-G包膜糖蛋白（最常用的LV假型）对生产细胞具有内在的细胞毒性和细胞抑制作用。这些限制不允许VSV-G包膜糖蛋白的组成型表达和具有高gag-pro-pol表达的稳定包装细胞的产生。克服这些细胞毒性问题的一种方法是通过使用诱导型启动子（如四环素诱导型表达系统）有条件地表达VSV-G包膜和gag-pro-pol基因，仅在生产期间激活表达，以防止细胞过早死亡（图2）。【37，38】或者，组成型包装系统利用无毒包膜糖蛋白，适用于LV假分型和gag-pro-pol基因的优化表达，以避免此类限制。

为了满足市场需求，LV生产需要尽可能节约成本。因此，考虑到临床应用对LV生产的严格要求，开发了可诱导的包装细胞系（表1）。【17】【40】细胞毒性蛋白的表达可以通过添加诱导物或去除抑制物来调节，以在确定的时刻开始LV的产生。最初开发的诱导型生产系统导致低滴度，但表达盒设计的进一步优化和升级允许达到类似水平的瞬时生产，如下文所述。

目前诱导型包装细胞系使用最多的系统仍然是Tet-Off和Tet-On系统（图2A，B）。在Tet-Off系统中，转录在四环素（Tc）或多西环素（Dox，Tc的类似物）存在时关闭，相反，在Tet-On系统中，基因的转录在Tc或Dox存在时开启。

Throm等人于2009年开发了可诱导的第二代GPRT（gag-pro-pol-rev和tat）和第三代GPR（gag-pro-pol-rev）、GPRG（gag-pro-pol-rev-VSVG）LV包装细胞系。这是通过用SIN-MLV载体转导所有包装构建体实现的，使用Tet-Off系统调节rev和tat的表达。转基因通过串联阵列转染技术引入，该技术被开发用于获得高载体基因组表达。高滴度产品（5×107t . u . mL-1）使这些包装细胞能够用于两项临床试验的生产细胞系。首先，用于治疗SCID-X的GPRG-TL20-GFP生产细胞系。Tet调节的转移载体构建体表达来自内部启动子EF1α的人白细胞介素2受体共同y链（IL-2Rγc）基因，其侧翼是两个鸡β-珠蛋白HS4绝缘体。这些绝缘体保护邻近基因免受内部启动子反式激活的影响。该细胞系除了在没有抗生素选择的情况下保持稳定1个月之外，还能够在诱导后的3个月内稳定产生107t . u . mL-1以上的滴度。【19，49，50】第二个细胞系650MNDhWASp1（来自GPRT-G）表达WAS蛋白用于治疗Wiskott Aldrich综合征。为了限制原癌基因的激活，转移载体还含有绝缘体元件。作为内部启动子，它有一个强γ-路LTR启动子而不是EF1α。这种有前途的细胞系在培养2个月后表现出稳定性，滴度超过107t . u . mL-1