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sgRNA体外转录试剂盒(PC1380)

 

产品简介:

     sgRNA体外转录试剂盒采用T7 RNA聚合酶复合物高效转录spCas9sgRNA。试剂盒中的反应体系根据sgRNA特点进行优化,每个反应可在4小时内获得多达100-200μg的sgRNA。sgRNA可直接用Cas9蛋白体外切割,纯化后可用于细胞注射等实验。

试剂盒中配备了合成sgRNA转录模板,sgRNA转录所需的全部试剂,用户仅需要合成含有1条CRISPR靶点的引物就能完成sgRNA体外转录。

 

产品内容:

储存条件-20℃冻存


使用前必读注意事项:
务必使用无RNA酶的枪头、离心管配制转录反应体系。


1、制备转录模板
1.1 设计PCR正向引物:
spCas9识别的靶点为20nt+NGG共23个碱基序列,我们以阳性对照的靶点序列为例说明设计引物的方法。


阳性对照的靶点序列为:
5’CTGCTAATCCTGTTACCAAGTGG-3’

需要合成的正向引物序列为:
5’- TTAATACGACTCACTATAGGG
CTGCTAATCCTGTTACCAAG GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’

1.2 PCR扩增转录模板
反应体系:


正向引物(10 μM)

0.8μl

SG-R primer

0.8μl

PCR template DNA

0.5 μl

2×PCR Mix

10μl

H2O

7.9μl

 

 

性对照反应:


Positive control Primer(10 μM)

0.8μl

SG-R primer

0.8μl

PCR template DNA

0.5 μl

2×PCR Mix

10μl

H2O

7.9μl

 

反应条件:
95℃ 5min
95℃ 30sec
56℃ 30sec    35 cycles
72℃ 30sec

扩增产物为117bp。扩增完成后用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

 

2sgRNA转录
操作过程中采用无RNA酶的吸头及离心管操作,并注意避免RNA酶污染。

 

2.1 转录反应
顺序加入以下反应物:
(1)反应体系:


无RNA酶水                                

 to 20 μl

5×Transcription Buffer

4 μl

NTP mix

8 μl

PCR产物

2 μl

T7 Transcription Enzyme mix

2 μl

*20ul体系sgRNA产量为100-200ug。如果下游实验所需sgRNA量较少,可以根据需要适当调整体系,但尽量不低于5ul。
(2)转录条件:充分混匀,37℃孵育4小时。
*孵育时尽量采用PCR仪等带有热盖的仪器,或者在37℃恒温培养箱反应。切勿使用水浴锅。

(3)转录完成后取少量反应液,稀释20倍后用琼脂糖凝胶电泳检测产物大小及完整性。

 

电泳方法:
(1) 取1μl转录产物,加入19μl无RNA酶水,混匀(稀释20倍)。
(2)取3μl稀释后样品,加入3μl 2×RNALoading Buffer。70℃加热10min,立即放置冰上。

(3)用2%琼脂糖凝胶电泳检测条带。


3、转录产物纯化
* 转录产物可以直接用于Cas9体外酶切反应。纯化步骤选做。
* 转录模板DNA对Cas9体外酶切没有影响,可以不用去除。如果要去除模板DNA,可以先用DNase I消化转录反应液,再进行纯化。
* 可以选用可靠公司生产的RNA纯化试剂盒进行纯化或者乙醇沉淀纯化。乙醇沉淀纯化方法见电子版说明书。


4、RNA定量
转录得到的sgRNA可以采用紫外分光光度计定量。一般20μl体系可以得到sgRNA 100~200μg


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