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293T-spCas9细胞株(C1203)

货号:C1203
培养基:DMEM高糖培养基+10%胎牛血清
消化液:0.25%胰蛋白酶,0.53mM EDTA
冻存液:50%胎牛血清,40%DMEM,10%DMSO
培养条件:37℃,5% CO2

 

细胞简介:
293T-spCas9细胞是用293T细胞构建的稳定表达spCas9蛋白(C端有NLS信号)的细胞株。在转入sgRNA表达质粒或者化学合成的sgRNA后可以对细胞基因组DNA进行定点切割。也可以配合验证载体pTYNE载体实现对基因敲除靶点的筛选和验证。

 

细胞特性:
表达基因:野生型spCas9,C端NLS信号
基因导入方法:慢病毒
筛选抗生素:puromycin
细胞克隆:单克隆细胞株

 

使用注意事项:

    • 293T-spCas9细胞采用嘌呤霉素筛选得到,表达嘌呤霉素抗性基因,而HEK293T细胞本身对G418有较高抗性,因此后续细胞筛选实验中不能采用这两种抗生素。
    • Cas9蛋白需要gRNA配合才能对定点切割细胞基因组。单独使用不能发挥基因敲除或者编辑作用。配套的gRNA表达载体有pGR系列载体和pGR-EGFP系列载体。293T-spCas9细胞推荐用pGR-Hygro(货号CR2013)和pGR-EGFP-Hygro(货号CR2016)。
    • 仅采用sgRNA表达载体对目标基因切割,细胞一般通过NHEJ (非同源重组末端连接, nonhomologous end-joining)进行修复,从而产生缺失突变。转入gRNA表达载体的同时转入同源重组的模板,可以通过同源重组实现基因突变或敲除。具体同源重组的设计和构建以及阳性细胞克隆筛选的方法请参照相关文献。

     

    细胞培养注意事项:

      • 293T-spCas9细胞对血清要求较高,采用高质量胎牛血清进行培养十分必要,我们采用GIBCO和HYCLONE的胎牛血清培养均能获得满意效果。切勿用新生牛血清或劣质胎牛血清培养。
      • 在细胞培养早期大量冻存细胞十分必要。
      • 293T-spCas9细胞传代培养中应保证细胞密度不高于80%,低密度传代对保持细胞状态极为重要。

       

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      C1203

       


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