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几种常见CRISPR/Cas9基因编辑实验方案——简便VS高效

RISPR/Cas9技术极大方便了基因编辑的操作。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑，其基本原理为：第一步先对需要编辑的位点进行切割，造成DNA断裂；第二步用细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复。从而产生需要的突变结果。

目前主要有两种方式进行基因敲除：通过邻端接合反应敲除目的基因或者通过同源重组敲除目的基因。邻端接合反应的优势在于只需要对DNA切割后，细胞自身就能修复。由于不需要重组载体，只需要转入Cas9蛋白和sgRNA就能开始实验，启动非常快速。同源重组法需要在导入Cas9蛋白和sgRNA的同时，转入同源重组的修复。

图1、几种基因编辑方法比较

邻端接合基因敲除

优点：

1、 只需构建一个载体就能开始实验，启动快速。

2、 实验设计简单。

缺点：

1、 突变随机。后期鉴定工作量大。

2、 基因功能缺失对细胞生长有影响时，很难获得敲除成功的细胞。

原理：

工作流程：

重组法基因敲除

优点：

1、 抗性基因稳定整合到基因组中，阳性率很高。

2、 筛选较为容易。

缺点：

1、 实验设计较复杂。

2、 需要同时构建基因敲除载体和重组修复载体，实验启动慢。

重组法基因敲除原理

重组法基因敲除流程

重组法定点突变

定点突变是对指定位置的一个或者数个碱基进行精确编辑。定点突变的目的不是基因功能缺失，而是基因功能的改变。

与重组法基因敲除相比，定点突变要求编辑后基因组上不能残留抗性基因。因此有一定可能未能正确突变的细胞在筛选中存活。定点突变基因编辑的难度要大于基因敲除。

在我们的pCas9gRNA7基因编辑载体中含有lig4和KU70抑制RNA，可以显著抑制非重组DNA修复途径，极大的提高定点突变成功率。

定点突变原理：

定点突变实验流程：  

pCas9gRNA7系列Cas9gRNA表达载体：适合各种基因编辑方法。

我们经过反复实验和验证，开发的pCas9gRNA7系列载体有多种型号，适合各种基因敲除和编辑的实验方案。

相关产品：

PC1400：Cas9体外酶切试剂盒

CR5002：pCas9gRNA载体构建试剂盒

CR5003：重组载体构建试剂盒