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Red同源重组系统的原理和应用

Red/ET 同源重组技术(Red/ET recombineering)是由来源于大肠杆菌 λ 噬菌体的蛋白对 Redα/Redβ 或来源于 Rac 原噬菌体的蛋白对 RecE/RecT 所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术，能对宿 主 DNA 序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。

1998 年，Zhang 等发现大肠杆菌(Escherichia coli) Rac 原噬菌体上的操纵子 recE/recT 编码的 蛋白能够高效地介导体内同源重组的发生[1]，而且 Muyers 等发现来源于大肠杆菌 λ 噬菌体的 Redα/ Redβ 蛋白与 RecE/RecT 蛋白有类似的介导同源重 组的功能[2]，Stewart 等将 Redα/Redβ 和 RecE/RecT 重组酶体系合并命名为“Red/ET 重组工程(Red/ET recombineering)”[3]。与体内自然发生的同源重组相 比，Red/ET 重组系统只需要 40–50 bp 的同源臂就能 实现高效的同源重组，这一点突破了酶切位点和长 片段 PCR 扩增的局限性对传统基因操作技术的限 制，通过合成引物的方式将短同源臂加在 PCR 产物 的两端，可以与任意位置的目标序列进行同源重组，同时 Red/ET 同源重组技术的操作过程在大肠杆菌 中完成，极大缩短了构建载体和基因修饰的步骤与 时间，因此 Red/ET 同源重组技术的应用已经越来越 广泛[4–5]。

Red/ET 重组工程结合反向筛选技术，可以对 DNA 进行无痕敲除、定点突变和模块替换等修饰。以噬菌体蛋白为基础构建的同源重组系统在 细菌基因修饰中应用广泛，不仅可以在大肠杆菌 中高效地修饰 DNA 序列，同样可以在其他多种细 菌中使用(表 1)。

来自大肠杆菌噬菌体的 Red/ET 重组系统只 能在部分与大肠杆菌亲缘关系较近的革兰氏阴性 菌中应用，而在与其亲缘关系较远的菌类中，该 系统的功能是受限制的。然而 Red/ET 重组系统 的建立却为我们在其他细菌基因组或者其噬菌 体基因组中寻找类似的重组酶蛋白提供了理论依 据和技术指导，目前已有多种利用细菌自身噬菌 体或原噬菌体的重组蛋白建立起的具有种属特 异性同源重组工程系统。2007 年 Kessel 等采用来 自革兰氏阳性细菌耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体 Che9c 中的 Redα/β 类似蛋白 gp60/61，构建了分枝杆菌特异性的重组工程系统， 能够以带有 50 bp 短同源臂的单链寡核苷酸作为底 物进行同源重组，通过点突变失活质粒上的潮霉素 抗性基因，在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌中的重 组效率分别可达到 104 CFU/μg DNA 和 103 CFU/μg DNA，而来源于大肠杆菌的 RecET 和 Redαβγ 则不 能在分枝杆菌中有效介导单链重组[24–25]。2012 年 Pijkeren 等在罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)中 找到与 recT 同源的 2 个基因 recT1 和 recT2，2 个基因编码的蛋白能够在乳酸杆菌中有效地介导 单链重组的发生[26]。

Red/ET 同源重组技术还能免建库从基因组中 直接克隆大型基因簇(图 3-B，表 2)，大大促进了微 生物次级代谢产物的异源表达研究。

Red/ET 同源重组技术不仅可以对大肠杆菌中 DNA 分子的任意位置进行精确的修饰，包括单碱 基改变和基因的插入与删除，而且现在已经能够 在多个其他细菌中工作。将来继续发现新的宿主 特异性重组酶，并使之能够在更多的细菌中(假单 胞菌、芽孢杆菌、伯克氏菌等)建立以 Red/ET 同 源重组技术为基础的高效遗传操作体系，促进微 生物功能基因组和基因组挖掘的发展。以全长 RecET 介导的线线重组为基础的免建库直接克隆 技术为大片段基因簇的研究奠定了基础，极大促 进了后基因组时代以异源表达为策略的微生物次 级代谢产物的发现和开发。 随着分子生物学和基因工程技术的发展， Red/ET 同源重组技术也在不断发展和完善，已经 成为基因功能研究中一项热门的技术，在基因组 学研究和微生物基因组功能挖掘中将扮演更重要的角色。