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blasticidin筛选稳转细胞

Blasticidin-S简介

杀稻瘟菌素S (blasticidin-S)是日本开发的第一个成功的微生物源杀真菌剂[1]。BS是原核生物和真核生物的有效蛋白质合成抑制剂，属于一组氨基酰核苷抗生素。它已被广泛用作苯汞杀真菌剂的替代品来控制由稻瘟病菌(完熟期；稻瘟病菌)。

杀稻瘟菌素-S在pH值为5-7的溶液中稳定，在pH值小于4时不稳定，在碱性条件下会随着氨的损失而分解。

Blasticidin-S的作用方式尚未完全了解，但是已知其生物活性的主要来源是通过干扰核糖体特异性结合位点的肽基转移来抑制原核生物和真核生物中的蛋白质生物合成。在靶病原体米曲霉的无细胞系统中，氨基酸向蛋白质中的掺入受到抑制，而其他代谢途径，包括糖酵解、电子传递、氧化磷酸化和核酸合成不受影响。最近对水霉Achlya bisexualis的研究表明，Blasticidin-S具有抑制DNA合成的附加效应。

研究者从稻田土壤中分离出负责脱氨反应的微生物，并鉴定为土曲霉S-712的真菌菌株。从真菌中纯化出负责该反应的酶，命名为BSD，并检测其酶学性质。BSD对Blasticidin-S及其类似物表现出高度的特异性。其他嘌呤核苷，如胞嘧啶、胞苷和脱氧胞苷，不发生脱氨基作用。

将表达BSD的质粒通过转染导入培养的哺乳动物细胞。BSD基因整合到基因组中并赋予细胞杀稻瘟菌素抗性。BSD基因的转染效率与常见的G418抗性基因（neo基因）的转染频率一样高。但是杀稻瘟菌素S比G418更快地杀死细胞。

Blasticidin-S作为哺乳动物细胞的筛选抗生素之一，可以单独使用或者配合puromycin，G418做多重筛选。

用Blasticidin-S筛选细胞

下面述了用Blasticidin-S筛选稳定细胞的方法。首先，需要用表达BSD基因的慢病毒载体（例如pLV-Bsd慢病毒基因过表达载体(VL3005)）来构建目的基因表达载体，并且包装成慢病毒。具体步骤可以参考慢病毒包装说明书。

转染前准备：测试Blasticidin-S使用浓度。

1. 推荐用于Blasticidin-S的测试浓度为:0，2，4，8，16，32ug/ml。

2. 向生长良好的细胞的细胞培养基中加入适当的药物浓度。细胞的汇合度不宜超过70%。培养体积不宜过小，至少要使用24孔板，推荐使用6孔板。

3. 观察时间为7天，中间每2天换液一次，并换液后补加Blasticidin-S，保持药物浓度不变。

4. 记录4-7天杀死全部细胞的浓度。

第一天：慢病毒转染细胞

1. 在显微镜下检查细胞，以确保它们处于良好的健康状态，大约70-80%汇合。

2. 吸取培养基，用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶化，用培养基重悬并计数，细胞密度约1^6/ml。

3. 用2ml细胞悬液/孔接种无感染对照孔。

4. 病毒应在冰上或室温下解冻，不要在水浴。

5. 以2ml细胞悬液/孔的总量*3制作一份细胞总混合液，按照1:1000加入polybrene（6mg/ml）（货号X2351）。

6. 接种3个孔，低、中和高病毒量各一个。加入的病毒体积为20ul、100ul、500ul。目标是能够选择一个感染效率约为30%-50%的病毒量。

7. 将平板640xg在30℃下旋转2小时（可选，对悬浮细胞的转染有一定帮助）。

8. 离心完成后，将平板置于37℃培养箱过夜。

第二天：换液

1. 在显微镜下检查细胞。如果细胞过密，需要传代，保证筛选时细胞密度在70%左右。如果细胞密度适合，则直接换液。

第三天：添加抗生素

1. 按照测试的筛选浓度向培养基中添加Blasticidin-S。

2. 每天观察细胞状态。注意比较对照组和病毒感染组的区别。隔天换液并重新添加抗生素。

3. 筛选4-7天，待对照组细胞全部死亡，即可对病毒感染组的细胞进行扩增、冻存以及检测。