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Hela-dCas9-VP64-MPH细胞株（C1209）

货号：C1209

培养基：MEM (含NEAA)培养基（gibco货号：41500083）+10%胎牛血清，Blasticidin 5ug/ml，Hygromycin 100 ug/ml

消化液：0.25%胰蛋白酶，0.53mM EDTA

冻存液：50%胎牛血清，40%DMEM，10%DMSO

培养条件：37℃，5% CO2

产品简介：

本细胞株产品是用两个慢病毒感染后，用抗生素筛选得到的稳定多克隆细胞株。用到的两个慢病毒载体分别为：

pLV-dCas9-VP64-Bsd：表达无DNA酶活性的dCas9蛋白与转录激活因子VP64的融合蛋白。该融合蛋白与sgRNA结合后，将定位于细胞基因组DNA的特定位置，并产生转录激活作用。pLV-dCas9-VP64-Bsd慢病毒载体表达Bsd抗性基因，转染细胞后，可以用Blasticidin筛选阳性细胞株。

pLV-MPH-Hygro：表达MS2/P65/HSF1融合蛋白。与sgRNA结合并协同产生转录激活作用。pLV-MPH-Hygro慢病毒载体表达Hygromycin抗性基因。

CRISPR-SAM采用无DNA切割活性的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，加上能与MS2蛋白结合的sgRNA2.0，特异性识别并结合含sgRNA靶点的启动子。MS2蛋白连接p65和HSF1转录激活蛋白（MPH融合蛋白）。通过多种转录激活蛋白的协同作用，能更好的摸底细胞内转录激活。

Hela-dCas9-VP64-MPH细胞稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MPH融合蛋白。只需要转入配套的sgRNA表达质粒或者人工合成的sgRNA就能实现基因特异性转录激活。

细胞特性：

表达基因：dCas9-VP64，MPH融合蛋白

基因导入方法：慢病毒

筛选抗生素：Blasticidin，Hygromycin

细胞克隆：多克隆细胞株

配套sgRNA序列：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTCAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTGAAATAAGGCTAGTCCGTTAT

CAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

NNNNNNNNN：靶点

使用注意事项：

1、  Hela-dCas9-VP64-MPH细胞采用Blasticidin和Hygromycin筛选得到，后续细胞筛选实验不能采用者两种抗生素。

2、  建议在培养过程中添加Blasticidin 5ug/ml，Hygromycin 100 ug/ml。

3、  CRISPR-SAM系统使用的sgRNA与普通sgRNA不同。请参照相关文献或者本说明书的序列进行设计。可以采用质粒表达或者人工合成。对目的基因的启动子的不同位置同时使用2-3个靶点可能达到更佳的转录激活效果。

4、  转录激活的效果与目的基因的本底表达量、靶点的位置和靶点周围序列、sgRNA导入方法和效率等多种因素相关，使用中有必要根据实验具体情况进行修改实验条件，以获得更好的实验结果。

慢病毒载体图谱：

采用Hela-dCas9-VP64-MPH细胞进行EGFR基因转录激活实验

sgRNA采用慢病毒载体pLV-SG20导入。靶点序列：CCACCGCTGTCCACCGCCTC

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C1209