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使用Cas9 kit配套筛选载体对阳性细胞进行筛选

     

    实验原理

    pEGFP/puro为提高基因敲除实验中阳性细胞检出率设计的载体,表达EGFP荧光蛋白和puromycin抗性基因。使用时pEGFP/puro与pCas9/gRNA1载体或者pCas9/gRNA3载体共转染,用荧光标签或者嘌呤霉素对转染后的细胞进行初步筛选,可以显著提高基因敲除成功细胞的阳性率,减少后续细胞克隆检测数量。这个步骤对于转染效率较低的细胞尤其有效。

     

    简要步骤

    设计靶点→构建pCas9/gRNA1载体→与pEGFP/puro共转染目的细胞→嘌呤霉素筛选2-3天→阳性细胞克隆扩增→检测基因敲除效果

     

    靶点设计和基因敲除载体构建

    方法请参考pCas9/gRNA1载体说明书或者Cas9试剂盒说明书

     

     

    实验步骤

    1) 转染前24小时将293T铺到6孔板中。
    2) 按照下列体系制备质粒稀释液


    pCas9/gRNA1 0.8ug

    pEGFP/puro 0.08ug

    DMEM培养基X ul

    总体积50ul

    3) 准备转染试剂稀释液:
    Polyfect-V转染试剂 1.6ul
    DMEM培养基 48.4ul
    4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
    5) 将转染液加入293T细胞。
    6) 24小时后加入puromycin至合适浓度。
    7)筛选3天后消化细胞,用有限稀释法将细胞接种到96孔板,标记单个细胞的孔,做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。
    8)约7-10天,细胞形成克隆。消化细胞,将部分细胞继续培养,部分细胞提取基因组DNA检测基因敲除结果。

     

    用到的产品:

    pTYNE载体 货号:CR1011

    pCas9/gRNA1载体 货号:CR1001

     


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