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货号:CR1004
pCas9/gRNA3载体用于动物细胞基因敲除。该载体表达的Cas9Nickase蛋白是野生Cas9蛋白的D10A突变体。与野生型Cas9蛋白不同,Cas9Nickase蛋白结合gRNA后对DNA进行单链切割,产生一个DNA缺口。单独Cas9Nickase产生的缺口产生的缺口一般会被修复,不会产生DNA突变。使用pCas9/gRNA3载体进行基因敲除时需要一对pCas9/gRNA3载体同时转染,对DNA正义链和反义链同时切割,才能使DNA双链断裂,产生基因敲除效果。
我们新推出pCAS9/gRNA1的配套筛选质粒pEGFP/puro。该质粒与pCAS9/gRNA3载体共转染细胞,提供荧光信号及筛选抗性,可以对转染阳性的细胞进行初步筛选,提高基因敲除成功率。
载体特性:
类型:哺乳动物细胞基因敲除载体
表达基因:gRNA;Cas9Nicknase蛋白
原核抗性:Ampicillin
用法简介:
pCas9/gRNA3载体中含有gRNA序列3’端49bp序列及polyT终止信号。gRNA包括基因特异靶序列的5’端序列通过载体中EcoRV酶切位点连接到载体上。连接后的完整序列见下:
U6 promoter→
tcttgtggaaaggacGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
GATATC:EcoRV克隆位点
AGCTA:人工插入gRNA 5’端序列
NNNNN:19nt靶点识别序列
AACTT:gRNA3’端序列
TTTTT:PolyT终止信号
实验流程:
将一对靶点分别构建到pCas9/gRNA3载体→与pEGFP/puro载体共转染细胞→筛选阳性细胞→检测靶基因敲除情况
Cas9Nicknase蛋白对靶点切割示意图
应用实例:
资料下载:
pCas9/gRNA3载体图谱 CRISPR/Cas9试剂盒使用说明