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pCas9/gRNA3基因敲除载体

货号：CR1004

 

pCas9/gRNA3载体用于动物细胞基因敲除。该载体表达的Cas9Nickase蛋白是野生Cas9蛋白的D10A突变体。与野生型Cas9蛋白不同，Cas9Nickase蛋白结合gRNA后对DNA进行单链切割，产生一个DNA缺口。单独Cas9Nickase产生的缺口产生的缺口一般会被修复，不会产生DNA突变。使用pCas9/gRNA3载体进行基因敲除时需要一对pCas9/gRNA3载体同时转染，对DNA正义链和反义链同时切割，才能使DNA双链断裂，产生基因敲除效果。

我们新推出pCAS9/gRNA1的配套筛选质粒pEGFP/puro。该质粒与pCAS9/gRNA3载体共转染细胞，提供荧光信号及筛选抗性，可以对转染阳性的细胞进行初步筛选，提高基因敲除成功率。

 

载体特性：

 

类型：哺乳动物细胞基因敲除载体
表达基因：gRNA；Cas9Nicknase蛋白
原核抗性：Ampicillin

 

 




 

 

用法简介:

pCas9/gRNA3载体中含有gRNA序列3’端49bp序列及polyT终止信号。gRNA包括基因特异靶序列的5’端序列通过载体中EcoRV酶切位点连接到载体上。连接后的完整序列见下：

U6 promoter→
tcttgtggaaaggacGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
GATATC：EcoRV克隆位点
AGCTA：人工插入gRNA 5’端序列
NNNNN：19nt靶点识别序列
AACTT：gRNA3’端序列
TTTTT：PolyT终止信号

实验流程：

将一对靶点分别构建到pCas9/gRNA3载体→与pEGFP/puro载体共转染细胞→筛选阳性细胞→检测靶基因敲除情况

Cas9Nicknase蛋白对靶点切割示意图



应用实例：

• pCas9/gRNA1基因敲除载体对照实验
• pCas9/gRNA3基因敲除载体对照实验
• 用pCas9/gRNA1载体敲除293T细胞中的TP53基因 
• 使用Cas9 kit配套筛选载体对阳性细胞进行筛选

 

资料下载：

pCas9/gRNA3载体图谱 CRISPR/Cas9试剂盒使用说明