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pCas9/gRNA3基因敲除载体

    货号:CR1004

     

    pCas9/gRNA3载体用于动物细胞基因敲除。该载体表达的Cas9Nickase蛋白是野生Cas9蛋白的D10A突变体。与野生型Cas9蛋白不同,Cas9Nickase蛋白结合gRNA后对DNA进行单链切割,产生一个DNA缺口。单独Cas9Nickase产生的缺口产生的缺口一般会被修复,不会产生DNA突变。使用pCas9/gRNA3载体进行基因敲除时需要一对pCas9/gRNA3载体同时转染,对DNA正义链和反义链同时切割,才能使DNA双链断裂,产生基因敲除效果。

    我们新推出pCAS9/gRNA1的配套筛选质粒pEGFP/puro。该质粒与pCAS9/gRNA3载体共转染细胞,提供荧光信号及筛选抗性,可以对转染阳性的细胞进行初步筛选,提高基因敲除成功率。

     

    载体特性:

     

    类型:哺乳动物细胞基因敲除载体
    表达基因:gRNA;Cas9Nicknase蛋白
    原核抗性:Ampicillin

     

     


     

     

    用法简介:

    pCas9/gRNA3载体中含有gRNA序列3’端49bp序列及polyT终止信号。gRNA包括基因特异靶序列的5’端序列通过载体中EcoRV酶切位点连接到载体上。连接后的完整序列见下:

    U6 promoter→
    tcttgtggaaaggacGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
    GATATC:EcoRV克隆位点
    AGCTA:人工插入gRNA 5’端序列
    NNNNN:19nt靶点识别序列
    AACTT:gRNA3’端序列
    TTTTT:PolyT终止信号

    实验流程:

    将一对靶点分别构建到pCas9/gRNA3载体→与pEGFP/puro载体共转染细胞→筛选阳性细胞→检测靶基因敲除情况

    Cas9Nicknase蛋白对靶点切割示意图

    应用实例:

  • pCas9/gRNA1基因敲除载体对照实验
  • pCas9/gRNA3基因敲除载体对照实验
  • 用pCas9/gRNA1载体敲除293T细胞中的TP53基因 
  • 使用Cas9 kit配套筛选载体对阳性细胞进行筛选
  •  

    资料下载:

    pCas9/gRNA3载体图谱 CRISPR/Cas9试剂盒使用说明

     

     


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