微信扫一扫

下载说明书

优惠信息
CRISPR/Cas9
细胞系服务
细胞株现货产品
慢病毒载体
服务
订购指南
关于我们

在线询价


*电子邮件:

*电话:

*单位:

*感兴趣的服务或产品:

详细说明:

看不清?点击更换看不清?

主页 > CRISPR/Cas9 > 基因敲除技术中心 >

用pCas9/gRNA1载体敲除293T细胞中的TP53基因

     

    实验原理

    TP53是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现TP53基因突变及功能丧失。我们将针对TP53基因设计的靶点构建到pCas9/gRNA1载体,转染293T细胞,构建了TP53基因敲除293T细胞系。

    1、本实验基因敲除原理:pCas9/gRNA1载体表达gRNA和Cas9蛋白。将靶点序列克隆到pCas9/gRNA1载体上,gRNA将诱导Cas9蛋白对靶点DNA进行切割,造成DNA断裂。细胞通过邻端连接( nonhomologous end-joining)修复重新连接DNA,造成靶点附近DNA序列缺失突变。

    Cas9切割原理:

    2、pTYNE载体靶点验证原理:将包括靶点在内的大约200bp基因组序列克隆到pTYNE载体。构建好的pTYNE载体与pCas9/gRNA1基因敲除载体共转染293T细胞。如果靶点有效,基因敲除载体对pTYNE载体载体切割,经过细胞修复后pTYNE上移码突变的EGFP基因得到修复,发出绿色荧光。

    3、阳性细胞筛选原理:pCas9/gRNA1载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和EGFP标签的载体pLV-EGFP(2A)puro和pCas9/gRNA1载体共转染,再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。

     

    简要步骤

    设计靶点→构建pCas9/gRNA1载体→pTYNE验证靶点→pCas9/gRNA1载体转染293T细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除

     

    靶点设计和基因敲除载体构建

    人TP53基因有多个mRNA和蛋白拷贝,2个转录起始位点,以及多个翻译位点。我们在TP53基因的第四外显子设计了2个CRISPR基因敲除靶点,以实现对所有TP53蛋白的编辑。

    靶点序列1:acctgccctgtgcagctgt

    靶点序列2:ttgattccacacccccgcc

    将靶点1和靶点2构建到pCas9/gRNA1载体,获得针对TP53基因的gRNA基因敲除载体pCas9/gRNA1-P531和pCas9/gRNA1-P532。构建方法同pCas9/gRNA1使用说明中的方法。

     

     

    靶点验证

    1、pTYNE-53验证载体构建

    为了验证基因敲除靶点的效率,我们把TP53第四外显子部分序列通过XhoI、HindIII酶切位点连接到pTYNE载体,通过pTYNE载体验证靶点的切割效率。构建完成的载体命名为pTYNE-53。

    构建完成后pTYNE-53载体序列:

    注: 黄色:CMV promoter;灰色:TP53第四外显子部分序列;绿色:EGFP序列;下划线:CRISPR靶点

     

    2、用pTYNE-53验证靶点

    1) 转染前24小时将293T铺到24孔板中。同时准备3个孔。
    2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

    组1(阴性对照)

    组2(靶点一)

    组3(靶点二)

    pTYNE-53 0.4ug

    pTYNE-53 0.4ug

    pTYNE-53 0.4ug

    pCas9/gRNA1空载体0.4ug

    pCas9/gRNA1-P531 0.4ug

    pCas9/gRNA1-P532 0.4ug

    DMEM培养基X ul

    DMEM培养基 X ul

    DMEM培养基 X ul

    总体积50ul

    总体积50ul

    总体积50ul

    3) 准备转染试剂稀释液:
    Polyfect-V转染试剂 4.8ul
    DMEM培养基 145.2ul
    4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
    5) 将转染液加入293T细胞。
    6) 48小时后检测EGFP荧光表达。

    验证实验结果

    图一:靶点效率检测。转染48小时候荧光照片。

    检测结果显示靶点一和靶点二均有效果,靶点一的效果优于靶点二。

     

     

    TP53基因敲除293T细胞筛选

    实验步骤

    1) 转染前24小时将293T铺到6孔板中。
    2) 按照下列体系制备质粒稀释液

    pCas9/gRNA1-P531 0.7ug

    pLV-EGFP(2A)puro 0.1ug

    DMEM培养基X ul

    总体积50ul

    3) 准备转染试剂稀释液:
    Polyfect-V转染试剂 1.6ul
    DMEM培养基 48.4ul
    4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
    5) 将转染液加入293T细胞。
    6) 48小时后加入puromycin至终浓度为3ug/ml。

    7)筛选3天后消化细胞,用有限稀释法将细胞接种到394孔板,标记单个细胞的孔,做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。

    8)约7-10天,细胞形成克隆。消化细胞,将部分细胞继续培养,部分细胞提取基因组DNA检测TP53基因敲除结果。

     

    克隆检测结果

    以细胞克隆提取出的基因组DNA为模板,PCR扩增TP53第4外显子基因序列,并测序。

    测序的20个克隆结果如下:

    单敲除细胞克隆

    12个

    双敲除细胞克隆

    2个

    未突变细胞克隆

    6个

    合计

    20个

     

    测序结果截图:

     

    用到的产品:

    pTYNE载体 货号:CR1011

    pCas9/gRNA1载体 货号:CR1001

     


  • 上一篇:Cas9蛋白稳定表达细胞系293T-Cas9对照实验
  • 下一篇:构建稳定Cas9过表达293T细胞系

  • 版权所有 重庆英茂盛业生物科技有限公司 网站备案:渝ICP备19010777号
    地址:重庆市江北区港桥支路4号聚丰国际C座7楼 电话:023-67630383
    产品订购:order@inovogen.com 产品咨询:market@inovogen.com

    Cas9/基因敲除稳定细胞系构建/稳转细胞株稳转细胞系现货产品