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构建稳定Cas9过表达293T细胞系

一、试剂

 

1. 细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。
 2. 转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。
 3. Cas9表达慢病毒（制备方法见Cas9慢病毒包装实验）。
4. 嘌呤霉素或者G418。

 

二、实验步骤

1、 转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。
 2、 取出制备好的Cas9表达慢病毒（pLV-Cas9-Puro包装得到，制备方法见Cas9慢病毒包装实验），室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：
 以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例
   1)病毒液 50ul
   2)细胞完全培养基到950ul
   3) 加入Polybrene到终浓度为6ug/ml
 3、 用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。
 4、 病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。
 5、 在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2-3天应该换液一次，去除死细胞，补加抗生素。
 6、 大约6-7天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，进行检测。

 

三、PCR检测细胞基因组中的Cas9基因

用基因组PCR检测293T-Cas9细胞中的Cas9基因。

 

鉴定引物：


 Cas9-F：ACAGTCTTCACGAGCACATC
 Cas9-R：TCCTCTTCATCCTTTCCCTA
 产物大小198bp


 步骤：

1、 分别提取293T-Cas9细胞和293T细胞的基因组DNA。
2、 PCR扩增
 

反应体系：
 2×Taq Mix    25ul
 Cas9-F（10uM）2ul
 Cas9-R（10uM）2ul
 基因组模板    5ul
 加水补足50ul

反应条件：95℃ 预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环。


 3、 电泳检测PCR产物



M：DL2000 DNA marker
 1：293T-Cas9扩增产物
 2：293T扩增产物

 

四、 相关实验

• Cas9表达慢病毒包装

• 用pTYNE载体验证Cas9过表达细胞系

五、 相关产品

• Cas9稳定表达细胞系