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Cas9蛋白体外酶切试剂盒(PC1400)



 

 

货号:PC1400
本产品主要用于CRISPR/spCas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验。可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。
试剂盒中提供了Cas9体外酶切所需试剂,包括spCas9蛋白,反应缓冲液,以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展Cas9体外酶切实验。

M:DL2000 DNA marker
4:Cas9蛋白加gRNA切割0min
3:Cas9蛋白加gRNA切割10min
2:Cas9蛋白加gRNA切割30min
1:Cas9蛋白不加gRNA切割30min



 

产品特点:

  • 采用野生型spCas9

  • 仅需30min完成酶切

  • 电泳检测结果,快速直观

 

产品规格

 货号

PC1400-S0

(5次)

PC1400-S1

(5次)

PC1400-0

(20次)

PC1400-1

(20次)

PC1400-5

(100次)

 

spCas9蛋白

25U

25U

100U

100U

500U

 

10 x spCas9 Buffer

35 ul

35 ul

150 ul

150 ul

600 ul

 

阳性对照sgRNA

-

10 ul

-

25 ul

125 ul

 

阳性对照DNA

-

20 ul

-

50 ul

250 ul

 

Cleaner试剂

25 ul

25 ul

100 ul

100 ul

500 ul

 

3M NaAc pH5.2

-

50 ul

-

150 ul

600 ul

活性定义:37℃,30分钟切割1ug 1kB DNA双链定义为1个活性单位。

储存条件:-20℃冻存


实验步骤:
1spCas9切割反应:
1.1 需准备:底物DNA,浓度大于100ng/ul;sgRNA,浓度大于200ng/ul。
!务必采用无RNA酶的耗材进行实验,注意防止RNA酶污染。

按照下表配制spCas9体外切割反应缓冲液,请按表中顺序加入:

 

spCas9蛋白

5 ul

sgRNA

1 ug(a ul

底物DNA

1~2 ug(b ul

10 x spCas9 Buffer

X ul*

*X=0.1 x (5+a+b)

 

 

阳性对照反应:

spCas9蛋白

5 ul

阳性对照sgRNA

5 ul

阳性对照DNA

10 ul

10 x spCas9 Buffer

2 ul

1.2吹吸混合均匀。

 

反应程序:
37℃ 30min

85℃ 10min

 

2、产物检测:


快速检测:

1)在反应体系中加入5ul Cleaner,混匀。55℃孵育5min。(本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作)

2)取5ul进行凝胶电泳检测(不必加入DNA Loading Buffer) 。

 

乙醇沉淀法检测:
本方案耗时约30min,电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作。

1)加水将反应产物补足50ul

2)加入50ul酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。

3)室温12000rpm离心5min。

4)取上清至新的1.5ml离心管,加入5 ul 3M NaAc pH5.2,混匀。

5)加入110ul无水乙醇,混匀。

6)4℃ 12000rpm离心10min。

7)去除上清,加入500ul 70%乙醇,震荡混匀。

8)4℃ 12000rpm离心5min。

9)去除上清,空离心2min,12000rpm,用移液器尽量吸去残留液体,开口室温放置2-5min。

10)加入10-15ul蒸馏水,震荡溶解沉淀。取3-5ul进行凝胶电泳检测。

 

阳性对照电泳图

阳性对照DNA为760bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物310bp、450bp。

 

M:DL2000 DNA marker
4:Cas9蛋白加gRNA切割0min
3:Cas9蛋白加gRNA切割10min
2:Cas9蛋白加gRNA切割30min
1:Cas9蛋白不加gRNA切割30min

 

产品保存和使用注意事项:

1.spCas9蛋白使用过程中尽量保持低温。

2.阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用,以免RNase污染导致降解。

3.若切割效果不理想,可提高sgRNA的含量。

 

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