spCas9体外酶切试剂盒 (PC1400)

货号：PC1400
本产品主要用于CRISPR/spCas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验。可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。
试剂盒中提供了Cas9体外酶切所需试剂，包括spCas9蛋白，反应缓冲液，以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展Cas9体外酶切实验。

产品特点：

• 采用野生型spCas9

• 仅需30min完成酶切

• 电泳检测结果，快速直观

产品规格：

活性定义：37℃，30分钟切割1ug 1kB DNA双链定义为1个活性单位。

储存条件：-20℃冻存

实验步骤：
1、spCas9切割反应：
1.1 需准备：底物DNA，浓度大于100ng/ul；sgRNA，浓度大于200ng/ul。
！务必采用无RNA酶的耗材进行实验，注意防止RNA酶污染。

按照下表配制spCas9体外切割反应缓冲液，请按表中顺序加入：

阳性对照反应：

1.2吹吸混合均匀。

反应程序：
37℃ 30min

85℃ 10min

2、产物检测：

快速检测：

1）在反应体系中加入5ul Cleaner，混匀。55℃孵育5min。（本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作）

2）取5ul进行凝胶电泳检测（不必加入DNA Loading Buffer） 。

乙醇沉淀法检测：
本方案耗时约30min，电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作。

1）加水将反应产物补足50ul。

2）加入50ul酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。

3）室温12000rpm离心5min。

4）取上清至新的1.5ml离心管，加入5 ul 3M NaAc pH5.2，混匀。

5）加入110ul无水乙醇，混匀。

6）4℃ 12000rpm离心10min。

7）去除上清，加入500ul 70%乙醇，震荡混匀。

8）4℃ 12000rpm离心5min。

9）去除上清，空离心2min，12000rpm，用移液器尽量吸去残留液体，开口室温放置2-5min。

10）加入10-15ul蒸馏水，震荡溶解沉淀。取3-5ul进行凝胶电泳检测。

阳性对照电泳图

阳性对照DNA为760bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物310bp、450bp。

M：DL2000 DNA marker
4：Cas9蛋白加gRNA切割0min
3：Cas9蛋白加gRNA切割10min
2：Cas9蛋白加gRNA切割30min
1：Cas9蛋白不加gRNA切割30min

产品保存和使用注意事项：

1.spCas9蛋白使用过程中尽量保持低温。

2.阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用，以免RNase污染导致降解。

3.若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。

使用本产品发表的文献：

Increasing NADPH impairs fungal H2O2 resistance by perturbing transcriptional regulation of peroxiredoxin - PMC

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