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使用Cas9 kit配套筛选载体对阳性细胞进行筛选

 

实验原理

pEGFP/puro为提高基因敲除实验中阳性细胞检出率设计的载体，表达EGFP荧光蛋白和puromycin抗性基因。使用时pEGFP/puro与pCas9/gRNA1载体或者pCas9/gRNA3载体共转染，用荧光标签或者嘌呤霉素对转染后的细胞进行初步筛选，可以显著提高基因敲除成功细胞的阳性率，减少后续细胞克隆检测数量。这个步骤对于转染效率较低的细胞尤其有效。

 

简要步骤

设计靶点→构建pCas9/gRNA1载体→与pEGFP/puro共转染目的细胞→嘌呤霉素筛选2-3天→阳性细胞克隆扩增→检测基因敲除效果

 

靶点设计和基因敲除载体构建

方法请参考pCas9/gRNA1载体说明书或者Cas9试剂盒说明书。

 

 

实验步骤

1) 转染前24小时将293T铺到6孔板中。
 2) 按照下列体系制备质粒稀释液

pCas9/gRNA1     0.8ug

pEGFP/puro         0.08ug

DMEM培养基X ul

总体积50ul




3) 准备转染试剂稀释液：
 Polyfect-C转染试剂 1.6ul
 DMEM培养基 48.4ul
 4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
 5) 将转染液加入293T细胞。
 6) 24小时后加入puromycin至合适浓度。
 7）筛选3天后消化细胞，用有限稀释法将细胞接种到96孔板，标记单个细胞的孔，做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。
 8）约7-10天，细胞形成克隆。消化细胞，将部分细胞继续培养，部分细胞提取基因组DNA检测基因敲除结果。

 

用到的产品：

pTYNE载体 货号：CR1011

pCas9/gRNA1载体 货号：CR1001