实验原理 TP53是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现TP53基因突变及功能丧失。我们将针对TP53基因设计的靶点构建到pCas9/gRNA1载体，转染293T细胞，构建了TP53基因敲除293T细胞系。 1、本实验基因敲除原理：pCas9/gRNA1载体表达gRNA和Cas9蛋白。将靶点序列...

一、试剂 1.细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。 2.转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。 3.Cas9表达慢病毒（ 制备方法见Cas9慢病毒包装实验 ）。 4.嘌呤霉素或者G418。 二、实验步骤 1、转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染...

...

...

...

...

...

...

...

...

...

我们根据pTYNE载体的序列设计了pCas9/gRNA1对照阳性质粒pCas9-P，该质粒上的gRNA与pTYNE上EGFP编码区上游结合。pCas9-P表达的Cas9蛋白和gRNA组合现对pTYNE载体切割，经细胞修复后，突变的pTYNE将表达出读码框正确的EGFP蛋白，发出明亮的绿色荧光。...

...

...

通过采用Cas9 D10A突变蛋白，对DNA进行单链而不是双链切割，解决CRISPR/gRNA系统中的脱靶问题。...